列奥纳多在1508年头几个月的生活(正如结果显示的那样，最后一个月他是在佛罗伦萨度过的)似乎奇怪地与抄写有了瓜葛，人们甚至会说这如同公证人的日子一般。列奥纳多坐下来写作时，他那位于拉加大街的小书斋里成堆的文件好像要把他变成矮子一样。他的肩膀弯成了弧形，胡子变得有点灰白，视力给他造成了极大麻烦。这一时期列奥纳多从事过一些我们近乎一无所知的艺术活动——为路易国王绘制“尺寸不一的两幅圣母画像”；一直创作并修改《蒙娜丽莎》；对鲁斯蒂奇西礼堂群雕提出建议；或许还有最后润饰《安加利之战》的巨幅片断——不过这却没有相关记载，也没有他与行政长官的来往（要是有的话）的记录。列奥纳多丢弃了这些关系，就像他放弃那些绘画那样容易。精神病学家可能会说，这是列奥纳多从其父那里学来的一门技艺。
或许，列奥纳多在佛罗伦萨最后几个月进行最为重要的一项活动时，手中拿的不是钢笔或画刷，而是一把解剖刀，这活动为广受重视的调查研究揭开了崭新的一章。在1507年晚期或1508年早期一份著名的备忘录中，列奥纳多记下了他对一位老人尸体的解剖过程：
这位老人在去世之前几个小时告诉我，他活了一百多岁，除了身体虚弱之外没有感到其它毛病。坐在佛罗伦萨新圣母玛利亚医院的病床上，他没有任何痛苦的动作或迹象就离开了人世。我对尸体进行了解剖，以查明是什么造成了这种甜蜜的死亡。
也正是在这时，列奥纳多解剖了一个两岁儿童的尸体，“我在其中发现了与那位老人尸体恰好相反的一切”。
列奥纳多现在主要对血管系统产生了兴趣。在一张绘有胳膊表层血管的草图中，他注明了那位“老人”与“孩子”之间静脉和动脉的差异。列奥纳多怀疑老人停止呼吸是因为“动脉缺乏滋养心脏及其下层组织的血液，从而引起身体虚弱所致”。他发现动脉“又干又窄，有些干瘪”，“除了血管壁变厚之外，脉管变长了，像蛇一样扭曲着”。列奥纳多还注意到肝脏因为失去了充分的血液供应，“颜色和成分都如同凝固的麸皮一样干枯了”；那位老人的皮肤“颜色像木头或干栗子一样，因为皮肤几乎完全失去了滋养”。在相关的一页上，列奥纳多还讨论了心脏和肝脏究竟哪个是血管系统的主要器官，并最终断定心脏是主要器官（认同亚里士多德的观点，反对伽林的看法），他把心脏比作了“血管图”从中孕育成长的桃子硬核。
这些语言（蛇，麸皮，木头，栗子还有桃核）非常符合实际生活，如同教材一般，这与列奥纳多在15世纪80年代后期较早的解剖学著作中采用的更加抽象的语言形成了鲜明对比。当时列奥纳多在解剖上主要关注官能、“主要活力”的输送以及其它中世纪的假设。列奥纳多在1508年晚些时候写成了一本论述光学的小册子（现在的巴黎手稿D），我们从中可以发现偏离形而上的类似迹象。这本小册子强调了眼睛在本质上易于接收外界事物，还有不存在从眼睛发射出来任何无形或“心灵”的光线（传统模式认为感觉就是以这种方式具有前摄性的）。正如列奥纳多喜欢诉说的那样，眼睛可能是“心灵的窗户”，但它同时也是一台微型机器，其运转部分必定要被分解或被人了解。
在1508－1509年这同一时期，列奥纳多还绘制了一些与肺脏及腹部器官有关的漂亮图表。画的或许是猪的器官，图表再度伴有和植物进行的类比。这些图表说明，列奥纳多当时是如何同显示解剖的问题苦苦进行着抗争，他在积极寻求一种能把表面细节和透明性结合起来的绘图技巧。瓦萨里记载了与列奥纳多有关的一段轶事，说他把猪内脏充满了气，直到内脏挤满了房间。这个插曲就是列奥纳多解剖猪的一个恐怖注解。列奥纳多喜欢让人感到惊慌不安，这是他性格中戏剧性的一面。
此时还出现了一幅画有女人扩大的阴户的素描。即使这幅素描表现的是一胎多子或产后的妇女，那生殖器还是不切实际得如同洞穴一般。 我很想把这奇怪的夸大和列奥纳多关于“洞穴”的早期文本联系起来，并借此说明，列奥纳多对探究“危险黑洞” 表现出了恐惧，这恐惧的一部分是和女性性征那令人烦扰的秘密相冲突的。根据弗洛伊德的解释，在洞穴之内可以瞥见的“奇物”是关于生殖和出生的秘密。然而，在这素描下面的注解中，列奥纳多却满足于一个更加简洁的象征：“阴户边上的褶皱告诉了我们城堡守门人的位置。”把女性生殖器设想为一个“城堡”或“要塞”，要遭到坚持不懈的男性包围和攻破，这在爱情诗中司空见惯。
在相关的纸上还有一幅草图，画的是一位站立的女性显示自己怀孕早期时候的子宫，还有几幅男性和女性生殖器的素描，一幅奶牛内怀胎儿的子宫习作，还有一份奶牛胎盘的局部图，列奥纳多将胎盘组织描述成了“如同粘附物一样交织在一起”。这些关于繁殖的习作似乎与列奥纳多在1508－1509年间创作的《丽达》的生殖主题有着某种联系，因为这位孕妇的轮廓在视觉上重复了丽达的形象。纸张精美的反面是嘴巴及其肌肉的习作，其中那些幽灵般的嘴唇似乎以柴郡猫般的风格从蒙娜丽莎的脸庞漂流而来。
关于“那位老人”的这些注解写于1507年晚期或1508年早期，它们最早明确指出了列奥纳多曾亲自进行过一次人体解剖。但或许以前他就解剖过其它尸体了，因为在另一张谈论解剖的纸张（1508年）上，列奥纳多声称他曾亲自解剖过——肢解成碎块——“十多具人尸”。为了“正确完美地了解”人体血管，列奥纳多已经“把这些血管周围的人肉去除得丝毫不剩，除了毛细血管一滴几乎看不见的流血之外。这几乎没有引起任何流血”。列奥纳多还记录了在冷冻出现之前解剖尸体时的程序问题：“由于一具尸体持续的时间不长，因此很有必要接连使用几具尸体，以便可以得出关于血管的完整结论。为了发现其中的差异，这个过程我重复了两次。”列奥纳多描述了这项任务的挑战性和由此带来的真正恐惧。“你们”——即将成为解剖学家的读者们——“可能会因为肚子的隆起而打退堂鼓”。
正如解剖“那位老人”和“孩子”的尸体一样，有些解剖显然是在新圣母玛利亚医院进行的。列奥纳多很熟悉这个地方，那是他的储藏室，偶尔也用作仓库。列奥纳多这么做肯定得到了某种官方的许可——1506年，即使佛罗伦萨画室中的“医生和学者”在圣克罗切进行公共解剖之前，也必须得到官员允许——但看来好像列奥纳多完成的这些解剖并非都是在那里进行的。列奥纳多充满感情地谈到了“午夜时候的恐惧，因为身边都是一些经过肢解和剥皮的死人，看了不禁令人毛骨悚然”。列奥纳多或许对尸体解剖进行了夸大，但其中的弦外之音在于他是在自己的寓所或画室内进行解剖的，因此才产生了他在尸体陪伴于身边时度过黑夜的那种恐惧。要是他在新圣母玛利亚医院解剖尸体，就不会感到恐惧了。
尸体解剖当时仍然存在争议。得到特许去进行解剖是可以的，但解剖仍然是项可疑的活动，其周围聚集着大量的谣言和迷信——这就暗示了它是一种“妖术”，迷信以及中世纪魔法的混合物。经常使用绞刑架下的尸体更加让人不寒而栗。列奥纳多急于使自己摆脱这些东西，这就是为什么他在描述尸体解剖的文章中也英勇地攻击了那些招摇撞骗的术士：
自然会替自身向那些希望实现奇迹的人们报仇……因为他们总是生活在最可怕的贫穷之中。对于那些力图制造金子和银子的炼金术士，那些希望从死水中创造出永不停歇的能量的工程师们，那些在所有人中最为愚蠢的巫师和魔术师来说，情况现在如此，将来也永远都是如此。
列奥纳多后来在罗马时，从事的研究使他与教会产生了冲突。一个幸灾乐祸的人把列奥纳多的活动向教皇作了汇报，结果列奥纳多被“禁止进行尸体解剖”。随着反宗教改革的进行，这样的态度强硬起来。半个世纪之后，比利时伟大的解剖学家，也就是《解剖学》的作者安德烈亚斯·维萨里因为“掘墓盗尸”和进行解剖被宗教裁判所判为死刑。判决后来改为让维萨里到耶路撒冷朝圣，但他在回来的途中就过世了，享年五十岁。
当列奥纳多谈到他在几具尸体的包围下度过夜晚时，我们得到一点暗示，他在紧闭的门后偷偷进行尸体解剖，这带有一点离经叛道的色彩。对列奥纳多来说，调查的需要总比个人舒适和教义安全的需要来得强烈。
